Εάν η πρωτεΐνη σας δεν έχει το ίδιο μέγεθος με το αντίσωμά σας, μπορείτε να εκλούσετε με 0,1M γλυκίνη, pH2-3 και στη συνέχεια να διαχωρίσετε την πρωτεΐνη που σας ενδιαφέρει από το αντίσωμα χρησιμοποιώντας SEC (όπως το superdex 200).
Τι είναι η έκλουση πρωτεΐνης;
Οι πρωτεΐνες εκλούονται με μια βαθμίδα αυξανόμενων ποσοτήτων ενός οργανικού διαλύτη, όπως το ακετονιτρίλιο. Οι πρωτεΐνες εκλούονται ανάλογα με την υδροφοβικότητά τους. Μετά τον καθαρισμό με HPLC η πρωτεΐνη βρίσκεται σε διάλυμα που περιέχει μόνο πτητικές ενώσεις και μπορεί εύκολα να λυοφιλοποιηθεί.
Γιατί οι πρωτεΐνες έχουν χαμηλό pH έκλουση;
Η χρήση ρυθμιστικού διαλύματος χαμηλού pH για έκλουση από την πρωτεΐνη Α είναι γνωστό ότι συμβάλλει στη συσσώρευση προϊόντος Ωστόσο, ένα πιο περιορισμένο σύνολο στοιχείων υποδηλώνει ότι το χαμηλό pH μπορεί να μην είναι το μοναδικό αιτία της συσσωμάτωσης στην πρωτεΐνη Α χρωματογραφία, μάλλον, άλλες πτυχές της διαδικασίας μπορεί να συμβάλει σημαντικά.
Πώς γίνεται η έκλουση;
Στην αναλυτική και οργανική χημεία, η έκλουση είναι η διαδικασία εξαγωγής ενός υλικού από ένα άλλο με πλύσιμο με διαλύτη; όπως στο πλύσιμο των φορτωμένων ρητινών ανταλλαγής ιόντων για την απομάκρυνση των δεσμευμένων ιόντων. … Αφού τα μόρια του διαλύτη εκτοπίσουν την αναλυόμενη ουσία, η αναλυόμενη ουσία μπορεί να μεταφερθεί από τη στήλη για ανάλυση.
Πόσα αντισώματα χρειάζεστε για το Coip;
Για πειράματα ρουτίνας Co-IP, το αντίσωμα που χρησιμοποίησα είναι όχι περισσότερο από 2ug (Στο σετ μου, 1,4 -2,0 ug αντισώματος επαρκούν για τη σύλληψη 2500-5000 ug προϊόν λύσης πρωτεΐνης.) Αλλά εξακολουθεί να εξαρτάται από τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών-στόχων στα δείγματά σας, επομένως μάλλον πρέπει να κάνετε κάποιες τροποποιήσεις.
