Κρατήστε τα ΚΡΥΑ! Η διαδικασία δημιουργίας ικανών κυττάρων είναι προκλητική λόγω της ανάγκης τα κύτταρα να παραμείνουν κρύα. Αυτό είναι κρίσιμο γιατί τα κύτταρα είναι τόσο ευαίσθητα και εύθραυστα ενώ γίνονται ικανά Η διατήρηση της θερμοκρασίας σε χαμηλά επίπεδα βοηθά στην αποφυγή κυτταρικού θανάτου κατά την επεξεργασία.
Γιατί οι αντιδράσεις διατηρούνται στον πάγο κατά τη διάρκεια του πειράματος μετασχηματισμού;
Το μίγμα πλασμιδίου-κυττάρου στη συνέχεια θερμαίνεται για λίγο στους 45–50°C, επιτρέποντας στο DNA να εισέλθει στο κύτταρο μέσω της διαταραγμένης μεμβράνης. Το θερμαινόμενο μείγμα στη συνέχεια τοποθετείται ξανά σε πάγο για να συγκρατηθούν τα πλασμίδια μέσα στα βακτήρια … Εάν το διάλυμα πλασμιδικού DNA έχει πάρα πολύ αλάτι μέσα, μπορεί να εμφανιστεί τόξο, που διακυβεύει τον μετασχηματισμό.
Γιατί τοποθετείτε τα σωληνάρια στον πάγο;
Γιατί πιστεύετε ότι βάζουμε τους σωλήνες στον πάγο; Για να μπει το DNA στα βακτήρια, πρέπει να ανοίξουμε τρύπες σε αυτά με τη χημική ουσία χλωριούχο ασβέστιο (CaCl2). … Οι τρύπες που άνοιξαν για να επιτρέψουν στο DNA να μπει αφήνουν τα βακτήρια να διαρρέουν. Αν δεν τα κρατήσουμε στον πάγο, θα «αιμορραγήσουν» μέχρι θανάτου.
Ποιος είναι ο ρόλος του παγωμένου χλωριούχου ασβεστίου στην παρασκευή ικανών κυττάρων;
Η διαδικασία μετασχηματισμού του χλωριούχου ασβεστίου με θερμικό σοκ ενθαρρύνει τα βακτηριακά κύτταρα να προσλάβουν DNA από το περιβάλλον. … Το παγωμένο διάλυμα CaCl2 διευκολύνει τη σύνδεση του DNA στην επιφάνεια του κυττάρου, το οποίο στη συνέχεια εισέρχεται στο κύτταρο μετά από μια σύντομη περίοδο θερμικού σοκ (3).
Πώς αποθηκεύετε ικανά κύτταρα;
Τα κατάλληλα κύτταρα θα πρέπει να φυλάσσονται στους - 80°C. Η αποθήκευση στους -20°C θα έχει ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση της αποτελεσματικότητας μετασχηματισμού (TE). Όταν δοκιμάστηκαν σε NEB 5-alpha Competent E. coli (NEB C2987H), τα κύτταρα έχασαν το 94,5% του TE μετά από μόνο 24 ώρες αποθήκευσης στους -20°C.
